Lymská borrelióza je ochorenie prenášané kliešťami, jeho epidemiologická, klinická, ale aj sociálna závažnosť v Európe, USA a v ďalších častiach sveta významne stúpa. Vzhľadom k tomu, že borrelia je významným patogénom človeka aj zvierat, v posledných rokoch bola stále väčšia pozornosť venovaná základným otázkam biológii a ekológii pôvodcu tohto ochorenia, vrátane molekulových mechanizmov patogenézy s cieľom preniknúť do podstaty interakcií Borrelii s ich prenášačmi a ich definitívnymi hostiteľmi.

Borrelie patria do čeľade Spirochaetaceae, rad Spirochaetales. B. burgdorferi je pohyblivá, grammnegatívna, dvojmembránová, špirálovitá patogénna baktéria, ktorá žije extracelulárne. Je dlhá 20-30 µm a veľmi tenká (0,2-0,25 µm). V periplazmatickom priestore pod vonkajšou povrchovou membránou sú na obidvoch koncoch bunky ukotvené bičíky. Ich počet sa pohybuje od 7 do 11. Borrelia sa ťažko kultivuje in vitro a vyžaduje špeciálne médiu a mikroaerofilné podmienky. Dlhodobá kultivácia Borrelii môže viesť k strate niektorých plazmidov, zmenám expresie proteínov a k strate schopnosti infikovať laboratórne zvieratá.

V súčasnosti existuje už pomerne dosť informácií o druhovom zložení komplexu Borrelia burgdorferi sensu lato. V rámci druhového komplexu dnes spoľahlivo rozlišujeme jedenásť druhov (B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii, B. japonica, B. valaisiana, B. andersonii, B. lusitaniae, B. bissettii, B. tanukii, B. turdae, B. sinica). Z uvedených jedenástich "genomospecies" sú B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzeliiB. valaisiana dokázateľnými pôvodcami lymeskej borreliózy. Druhy sa líšia geografickým rozšírením, prítomnosťou rôznych kombinácií plazmidov, skladbou antigénov, zastúpením štruktúrnych zložiek a ich funkčnými aktivitami. Dôsledkom spomenutých molekulových odlišností existujú aj značné rozdiely v klinickom obraze systémového ochorenia Lymeskou borreliózou.

Borrelia burgdorferi - modelový organismus molekulovej parazitologie

Borrelia burgdorferi je jedným z organizmov, u ktorého je známa sekvencia celého genómu. Genóm baktérie Borrelia burgdorferi kmena B31 obsahuje lineárny chromozóm a minimálne 17 lineárnych a cirkulárnych plazmidov. Veľkosť chromozómov je 910 725 párov báz a priemerný obsah G+C párov je 28,6%. 853 predpokladaných kódujúcich sekvencií (ORF), má priemernú veľkosť 992 bp, podobne ako to je u iných prokaryotických genómov. 93% chromozómu reprezentujú kódujúce sekvencie. 59% génom z celkového počtu 853 bola pripísaná biologická funkcia, 12% ORF je homologických s hypotetickými sekvenciami neznámej funkcie z iných organizmov a 29% ORF sú nové gény. Priemerná molekulová hmotnosť proteínov kódovaných na chromozóme je 37 529 (rozpätie od 3 369 do 254 242). Tieto hodnoty zodpovedajú pozorovaniam u iných baktérií. Analýza kodónov ukázala, že sa využívajú všetky 61 tripletové kodóny. Najčastejšími aminokyselinami sú Ile (10,6%), Leu (10,3%), Lys (10,2%), Ser (7,8%), Asn (7,2%). Vysoké hodnoty Lys korelujú s priemernou vypočítanou hodnotou izoelektrického bodu 9,7.

Chromozóm obsahuje gény kódujúce proteíny zahrnuté v DNA replikácii, transkripcii, translácii, transporte látok a energetickom metebolizme, ale neobsahuje gény pre biosyntézu látok.

Genóm Borrelia burgdorferi (kmeň B31) obsahuje okrem lineárneho chromozómu aj lineárne a cirkulárne plazmidy, ktorých názvy a veľkosti sú zhrnuté v tabuľke:

Tabuľka 1. Prehľad plazmidov spirochéty Borrelia burgdorferi kmeň B31
Lineárne plazmidyCirkulárne plazmidy
OznačenieVeľkosť (kbp)Počet kópií v bunkeOznačenieVeľkosť (kbp)Počet kopií v bunke
lp56561cp32325-6
lp54541cp26261
lp49491cp991
lp38381
lp36361
lp28284
lp25251
lp17171

Niektoré plazmidy sa môžu strácať počas kultivácie (napr. jeden lp28, jeden alebo dva cp32).

Plazmidy obsahujú celkom 430 predpokladaných ORF s priemernou veľkosťou 507 bp. Pomer G+C sa pohybuje medzi 23,1-32,3%. Len 71% plazmidovej DNA predstavuje predpokladané kódujúce sekvencie, čo je výrazne nižšia hodnota ako v prípade chromozómu. To naznačuje, že vzdialenosti medzi génmi sú väčšie u plazmidov ako na chromozóme, a že niektoré potencionálne ORF obsahujú posunutý čítací rámec alebo stop kodóny. Z celkového počtu 430 ORF bolo do teraz identifikovaných iba 76 (=16%) a patria medzi ne membránové proteíny, ako OspA-D, decorin binding proteíny atď. 100 ORF (23%) je homologických s ďalšími hypotetickými proteínmi z plazmidov ďalších príbuzných kmeňov Borrelii. 10 ORF (23%) je homologických s hypotetickými proteínmi z iných rodov ako Borrelia. 250 ORF (58%) nevykazuje žiadne homológie s databázou.

Gény kódované na plazmidoch majú väčšinou súvislosť s virulenciou a infekčnosťou, avšak biologická úloha väčšiny z nich nie je známa.

Malá veľkosť genómu Borrelii je spojená so zrejmou absenciou génov, ktoré sú zahrnuté v syntéze aminokyselín, mastných kyselín, enzýmových faktorov a nukleotidov.

Chromozóm Borrelii obsahuje 46 ORF a plazmidy 6 ORF, ktoré kódujú transportné proteíny. Produkty týchto génov tvorí 16 membránových transportných proteínov pre aminokyseliny, cukry a ióny. Nie je úplne jasné, akým spôsobom môže tak obmedzené množstvo prenášačov zastávať rôzne fyziologické reakcie. Niekoľko popísaných prenášačov predstavuje širokú substrátovú špecifitu ako napr. glycín, betain, L-prolin transportný systém (preVWX). Borrelia pravdepodobne kompenzuje svoj obmedzený kódujúci potenciál produkcie proteínov, ktoré môžu importovať široké spektrum látok. Neboli identifikované žiadne transportné systémy pre nukleozidy, nukleotidy, NAD/NADH a mastné kyseliny. Glukóza, fruktóza, maltóza a disacharidy sú získavané systémom fosfoenolpyruvát:fosfotransferáza (PTS).

Pre Borrelie je typická obmedzená metabolická výkonnosť. Boli identifikované všetky gény kódujúce enzýmy glykolytického reťazca. Analýza metabolických dráh naznačuje, že Borrelia vyžíva glukózu ako primárny zdroj energie, ale aj ostatné sacharidy (karbohydráty) ako glycerol, glukozamin, fruktóza a maltóza môžu byť v glykolýze tiež využité. Pyruvát produkovaný glykolýzou je premenovaný na laktát. Tvorba redukčnej sily prebieha oxidatívnou cestou pentózového cyklu. Žiadne z génov kódujúce proteíny Krebsovho cyklu alebo oxidatívnej fosforylácie neboli doteraz identifikované.

Pridanie N-acetylglukozaminu (NAG) do kultivačného média je potrebný pre rast Borrelii. NAG je inkorporovaný do bunkovej steny a môže slúžiť aj ako zdroj energie. NAG je základná zložka chitinu, ktorý tvorí kliešťovú kutikulu a môže byť zdrojom cukrov pre Borreliu, keď je asociovaná s kliešťom. Borrelia môže metabolizovať NAG na fruktóza-6-fosfát, ktorý môže byť ďalej zužitkovaný v glykolýze.

Borrelii burgdorferi chýbajú transportné proteíny dýchacieho reťazca, preto musí byť produkcia ATP dosiahnutá pomocou substrátovej fosforylácie. Gény pre ATP sa skôr podobajú svojou veľkosťou a sekvenčnou podobnosťou eukaryotickým ATP syntetázam viac ako bakteriálnym F1F0 ATP syntetázam.

Antigénne složenie borrelii

V poslednom desaťročí bolo venované veľké úsilie identifikácii povrchových antigénov zodpovedných za vyvolanie protektívnej imunitej odpovede proti Borreliam ako potencionánym kandidátom pre vývoj vakcíny a detekčných systémov. Imunizácia proteínmi OspA, OspB, OspC, alebo OspF zaisťuje efektívnu ochranu zvierat v experimente proti Borreliam. Avšak gény kódujúce tieto proteíny sú lokalizované na plazmidoch a vykazujú vyšší stupeň sekvenčnej heterogenity ako gény kódované chromozomálne. Naviac stupeň expresie týchto antigénov môže byť redukovaný na úrovni transkripčnej regulácie alebo stratou plazmidov. Preto sa vyvíja snaha identifikovať chromozomálne kódovaný povrchový antigén, ktorý bude poskytovať širokú ochranu.

Ďalej sú študované enzýmové aktivity Borrelii a väzbové aktivity štruktúrnych zložiek, ktoré sú zapojené v procesoch rozpoznávania receptorov, prípadne ďalších informačných molekúl, ktoré sa uplatňujú v molekulových mechanizmoch patogenézy.

Najlepšie preštudovanými antigénmi sú povrchové proteíny vonkajšej membrány označované OspA, -B, -C s veľkosťou molekúl 31, 34 a 25-25 kDa. Gény pre OspA a OspB sú umiestnené na lineárnom plazmide 45 kb. Variabilita týchto dvoch determinantov je u euróskych kmeňov Borrelii väčšia ako v severnej Amerike. V mnohých prípadoch jeden alebo do konca obidvaja chýbajú v antigénnej výbave Borrelii úplne a dominantným povrchovým proteínom je potom OspC, ktorého gén sa nachádza na cirkulárnom plazmide 26 kb. OspC sa vyskytuje ako dimér. Domény exponované na povrchu bunky sú vysoko variabilné a podobajú sa variantnému povrchovému glykoproteínu (VSG) Trypanosómy brucei. Ďalšie z povrchových antigénov B. burgdorferi lipoproteíny OspD (28 kDa, gén na lineárnom plazmide 38 kb), OspE, -F (19 a 26 kDa) či proteín p27 boli identifikované ako štruktúrne zložky vonkajšej membrány Borrelii s rôznym stupňom expresie u jednotlivých izolátov a v závislosti na fáze životného cyklu Borrelii.

Ďalšími významnými antigénmi sú bičíkové proteíny Borrelii. Bičík Borrelii sa skladá z dvoch proteínov FlaA (37 kDa) a majoritného FlaB (41 kDa). Bolo dokázané, že FlaA podlieha posttranslačnej glykozilácii. FlaA spúšťa včasnú IgM protilátkovú imunitnú odpoveď u pacientov s Lymskou boreliózou a býva často využivaná ako marker v diagnostických sadách.

Zásadným poznatkom z pohľadu molekulových mechanizmov patogenézy sa javí objav receptora Borrelii pre cicavčí plazminogén. Väzba plazminogénu na plazminogénový receptor zosilňuje aktiváciu plazminogénu cicavčími plazminogénovými aktivátormi na aktívny plazmín. Plazmín je serínová proteáza so širokým spektrom účinku, ktorá degraduje fibrín a nekolagénové proteíny extracelulárnej matrix a aktivuje latentné prokolagenázy čím napomáha účinnému šíreniu spirochét vo vnútri hostiteľa.

V poslednej dobe boli identifikované ďalšie dva povrchové lipoproteíny Borrelii s veľkosťou 20 a 22 kDa ako štruktúrne jednotky receptoru pre dekorin, proteoglykán asociovaný na povrchu kolagénu. Bolo dokázané, že dekorínový receptor funguje v experimentálnych infekčných myšiach ako protektívny antigén.

Ďalším študovaným antigénom je integrálny membránový proteín p66 (gén na chromozóme), ktorého funkcia bola dlhú dobu nejasná. Nedávno bol proteín p66 identifikovaný ako ligand pre beta(3)-chain integríny. Boli identifikované dva segmenty p66 dôležité na rozpoznanie alpha(IIb)beta(3)integrínom. Alpha (IIb)beta(3)integrín je receptor na povrchu krvných doštičiek a normálne je zahrnutý v procese zrážania krvi. Expresia receptora je podmienená aktiváciou doštičiek a väzba spirochét bola pozorovaná iba k aktivovaným doštičkám.

Z doterajších poznatkov o povahe interakcií medzi bakteriálnymi patogénmi a ich receptormi v hostiteľských organizmoch vyplýva, že významnou skupinou molekúl, ktoré sa zapájajú do procesu adherencie sú lektíny/aglitiníny, proteíny schopné vstupovať do neväzbových interakcií so sacharidovými zložkami receptorových štruktúr. Počas prenosu patogénnych mikroorganizmov vektormi ako aj pri šírení infekcie v organizme hostiteľa pripadajú do úvahy reciproké neväzbové interakcie proteín-sacharid. To znamená, že sa môžu uplatniť ako lektíny prenášaného patogénu špecifické napríklad pre sacharidové receptory vnútorných tkanivových systémov prenášača, tak aj naopak interakcie tkanivových špecifických lektínov prenášača s cukornými zložkami na cieľových antigénoch na povrch patogénu. Vypracované práce na túto tému sa zaoberali identifikáciou týchto sacharidových štruktúr (glykánov) u Borrelii ako petencionálnych receptorov pre interakciu s tkanivovo špecifickými lektínmi kliešťov.

Literatúra

  1. Barbour AG, Hayes SF. (1986). Biology of Borrelia species. Microbiol Rev. 1986;50:381-400.
  2. Steere AC. Lyme disease. N. Engl. J. Med. 1989;321:586-97.
  3. Sharon N, Lis H. (1989). Lectins. Chapman and Hall 1989, 26-36.
  4. Saint Girons I, Old IG, Davidson BE. Molecular biology of the Borrelia, bacteria with linear replikons. Microbiology 1994;140:1803-16.
  5. Baranton G, Old IG. (1995). The spirochaetes: a different way of life. Bull Inst Pasteur. 1995;93:63-95.
  6. Fraser et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature 1997;390:580-6.
  7. Stanek G. Biology of Borrelia burgdorferi, Risk of infection with Lyme borreliosis. In: Tick borne encephalitis and Lyme borreliosis, Sus J, Kahl O. (Eds.), Pabst Scientific Publications Germany 1997, 230-7.